嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride)

嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride)是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質粒轉染/轉化、病毒感染等方法能表達pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細胞。Puromycin不僅用于穩定細胞株的篩選，也用于穩定細胞株的維持。本產品的10mg/ml包裝經過濾除菌，可以直接用于細胞培養。

Puromycin的特點是快速作用于細胞，一般2 d內可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。

在革蘭氏陽性菌、動物或昆蟲細胞中，嘌呤霉素通過抑制蛋白質合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點結合后，不會參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

Pac基因表達嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發現的。如果表達基因，就會對嘌呤霉素產生抗性，這一特性目前普遍應用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩定細胞株等。例如，很多商業化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質粒圖譜上標記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩定表達細胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

訂購信息

藍冰運輸。-20℃保存，有效期24個月。

技術參數

1.CAS：58-58-2
2.分子式：C22H29N7O5•2HCl

3.分子量：544.43

4.純度：>98%

5.結構式：

使用方法

1.推薦工作濃度：

推薦的作用于哺乳動物細胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/ml，但最佳工作濃度需要通過劑量反應曲線來確定。

表1. 部分常見哺乳動物細胞的推薦工作濃度表

2.嘌呤霉素劑量反應曲線的確定(以shRNA轉染或者慢病毒感染為例）
　　嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關。為了篩選到穩定表達的shRNA或感染病毒的細胞株，確定殺死未轉染/感染細胞的zui低濃度嘌呤霉素非常重要。對于初次使用的細胞，一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve)。
（1）第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細胞，接種夠量的孔以便進行后續的劑量梯度實驗。細胞培養箱內培養過夜。
（2）第二天：在培養過夜后的細胞中更換新鮮配制的篩選培養基，該篩選培養基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，更換培養基后在細胞培養箱中繼續培養。
（3）第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于細胞，一般2d內可以殺死99%的未表達pac基因的細胞，所以在加嘌呤霉素后的1-2 d就可以進行觀察細胞存活率，從而確定有效殺死正常細胞的藥物zui低濃度。如果細胞耐藥性比較強，需要每日觀察，一般4-10 d內即可確定嘌呤霉素的zui低濃度。
3. 哺乳動物穩定表達細胞株的篩選
轉染含有pac基因的質?；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞?，即可篩選穩定表達株。
（1）細胞轉染或感染48 h后，將細胞置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養，此為處理組。
【注】：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用zui明顯。細胞過于密集，抗生素產生的效力會明顯下降，所以細胞的密度最好不超過25%。建議同時做一個正常細胞的對照組。轉染或感染48 h后，如果細胞過密也可以消化后重新接種細胞，培養過夜后即可進行嘌呤霉素篩選。
（2）每隔2-3 d，更換含有嘌呤霉素的培養基。
（3）篩選7 d后，對照組正常細胞應該100%死亡，處理組中存活的細胞為表達pac基因的細胞。然后根據實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。
【注】：每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10 d。
（4）待細胞可以穩定生長后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續的培養。在得到穩定表達細胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續加入，并2-3 d更換含有嘌呤霉素的新鮮培養液。

注意事項

1.本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.用于細胞實驗，溶解后，須用一次性針頭濾器過濾除菌。

3.抗生素不穩定，請在有效期內盡快使用。

4.以上數據均來自公開文獻，和元李記暫未本產品進行獨立驗證，僅供參考。